Spektroskopia Ramana, SERS, TERS

Dr Jakub Prauzner-Bechcicki – Uniwersytet Jagielloński

Zjawisko Ramana

Spektroskopia Ramana jest jedną z podstawowych technik spektroskopii molekularnej. Może być również stosowana do badania ciał stałych. Wyróżnia się jednak spośród innych technik spektroskopowych, gdyż oparta jest na zjawisku rozpraszania światła a nie absorpcji bądź emisji. By zrozumieć zasadę działania tej metody badawczej, konieczne jest omówienie zjawiska Ramana. Zjawisko to w skrócie można określić jako nieelastyczne rozpraszanie światła. Energia rozproszonego fotonu może być większa lub mniejsza niż energia fotonu padającego, tj. padające światło niebieskie może zostać rozproszone jako zielone lub fioletowe. Prawdopodobieństwo zaobserwowania takiego aktu nieelastycznego rozproszenia jest bardzo małe, ok. 1 na 10⁷ fotonów podlega temu procesowi. Korzystne jest zatem użycie lasera jako źródła światła rozpraszanego.

Co ciekawe, zjawisko nieelastycznego rozproszenia światła zostało odkryte na długo przed wynalezieniem laserów. Po raz pierwszy zaobserwował je w 1928 roku Chandrasekhar Venkata Raman, od którego nazwiska zostało nazwane. Za obserwację tego zjawiska otrzymał nagrodę Nobla w 1930 roku. Z faktów historycznych warto wspomnieć, że wspomniany efekt wpierw został przewidziany teoretycznie przez Adolfa Smekala w roku 1923.

Prawdopodobieństwo nieelastycznego rozproszenia fotonu jest wyjątkowo małe – mówimy, że zjawisko to ma bardzo mały przekrój czynny. Dla porównania przekrój czynny na fluorescencję jest wyższy o 13-15 rzędów wielkości, a na absorpcję w IR o 9-11 rzędów wielkości. Tym bardziej na uznanie zasługuje fakt, że Raman był w stanie zaobserwować efekt nieelastycznego rozpraszania nie posługując się laserem jako źródłem światła. Obecne układy eksperymentalne do spektroskopii ramanowskiej składają się z lasera jako źródła światła, układu optycznego do zbierania światła oraz spektrometru wyposażonego w kamerę CCD.

Struktura energetyczna molekuł

Zaczniemy od skrótowego odświeżenia podstawowych wiadomości na temat struktury energetycznej molekuł. W związku z tym, że w odróżnieniu od atomów molekuły posiadają więcej niż jedno jądro atomowe struktura energetyczna molekuł jest bardziej złożona. Prócz poziomów elektronowych obserwujemy również poziomy energetyczne związane z oscylacjami i obrotami molekuł. Poziomy oscylacyjne (nazywane również wibracyjnymi) związane są z przemieszczeniami jąder atomowych w molekule względem siebie. Energie związane z przejściami pomiędzy kolejnymi poziomami oscylacyjnymi znajdują się w zakresie od kilku do setek meV (co odpowiada podczerwieni). Przejścia między poziomami rotacyjnymi, związane z obrotami molekuły jako całości, lokują się w zakresie mikrofal. W ogólności jeśli energia zaabsorbowana przez molekułę jest rzędu elektronowoltów, to będziemy obserwowali przejście uwzględniające zmianę poziomu elektronowego, oscylacyjnego i rotacyjnego.

Spektoskopia Ramana a inne techniki spektroskopowe

Strukturę poziomów energetycznych molekuł bada się przy użyciu różnych technik spektroskopowych. Wymienić tu można spektroskopię mikrofal, IR, laserową, fotoelektronów i ramanowską. Jak już wspomnieliśmy, ostatnia z tych technik jest odmienna w swej naturze od pozostałych. Mianowicie opiera się ona na zjawisku nieelastycznego rozpraszania światła, a nie bezpośrednio na zjawisku absorpcji i emisji promieniowania.

Podstawy spektroskopii ramanowskiej

Spektroskopia Ramana, choć daje wgląd w strukturę oscylacyjno-rotacyjną nie wykorzystuje do pozyskiwania tejże promieniowania podczerwonego. Dzieje się tak, gdyż opiera się ona o zjawisko nieelastycznego rozpraszania światła a nie absorpcji promieniowania charakterystycznego dla przejść oscylacyjno-rotacyjnych. Na czym polega zjawisko nieelastycznego rozpraszania światła – zjawisko Ramana? Rozważmy falę świetlną padającą na molekułę dwuatomową (przyjmijmy taki układ dla uproszczenia rozważań i jasności wywodu), której rozmiary, tj. odległość równowagowa, są znacznie mniejsze aniżeli długość fali światła padającego, λ_in≫R. Część elektryczna fali padającej ma postać E_in=E₀cos(ω_int). Oscylujące pole elektryczne powoduje przemieszczenia się chmury elektronów molekuły (patrz Rysunek 1) doprowadzając tym samym do powstania zmiennego w czasie dipola elektrycznego, d(t)=αE₀cos(ω_int), gdzie α oznacza polaryzowalność molekuły.

Teraz, jeśli molekuła oscyluje zmianie będzie ulegała również polaryzowalność. Traktując polaryzowalność jako funkcję odległości międzyjądrowej, możemy ją rozwinąć w szereg wokół położenia równowagi, Rₒ:

Traktując oscylacje molekuły jako ruch harmoniczny, tj. , otrzymujemy:

Tak otrzymane wyrażenie na zmianę polaryzowalności w funkcji zmiany odległości międzyjądrowej wstawimy teraz na wyrażenie opisujące nasz oscylujący dipol

Pierwszy wyraz opisuje rozpraszanie bez zmiany częstości fali padającej (rozpraszanie elastyczne), tzw. rozpraszanie Rayleigha. Następny człon opisuje rozpraszanie nieelastyczne, tzw. rozpraszanie Ramana. Jak widzimy zawiera ono dwa człony, jeden o pomniejszonej a drugi o powiększonej częstości. O ich pochodzeniu nieco więcej można powiedzieć opisując kwantową naturę owego zjawiska.

Przejścia pomiędzy poziomami energetycznymi

W kwantowym opisie zjawiska rozpraszania mówimy o przejściach pomiędzy rzeczywistymi poziomami oscylacyjnymi w molekule a poziomami wirtualnymi (patrz Rysunek 2). Układ zachowuje się tak jakby absorbował promieniowanie o energii i przechodził ze stanu podstawowego oscylacyjnego do wzbudzonego stanu wirtualnego. Ze stanu wirtualnego układ może powrócić do stanu podstawowego oscylacyjnego oddając dokładnie taką samą porcję energii. Mamy wtedy do czynienia z rozpraszaniem Rayleigha. Istnieje też niezerowe prawdopodobieństwo na przejście ze stanu wirtualnego do któregoś ze wzbudzonych stanów oscylacyjnych. W takim przypadku, w postaci promieniowania jest zwrócona porcja energii pomniejszona o energię wzbudzenia do wzbudzonego stanu oscylacyjnego, tj. . Mamy wtedy do czynienia z rozpraszaniem Ramana i mówimy o części stokesowskiej widma ramanowskiego, przez wzgląd na to, że częstość fali rozproszonej jest mniejsza niż częstość fali rozpraszanej (podobnie jak to ma miejsce w zjawisku fluorescencji, gdzie światło wyemitowane ma częstość niższą niż zaabsorbowane; w tym przypadku ta reguła nosi nazwę prawa Stokesa).

Istnieje w końcu również niezerowe prawdopodobieństwo, wyższe w wyższych temperaturach, że rozpraszane światło zastanie nasz układ we wzbudzonym stanie oscylacyjnym. Wtedy następuje absorpcja światła i przejście do stanu wirtualnego, a następnie reemisja promieniowania o wyższej energii z równoczesnym przejściem do poziomu podstawowego oscylacyjnego. Początkowe wzbudzenie molekuły zostało wydatkowane na zwiększenie energii wypromieniowanego światła, tj. . Mówimy wtedy o antystokesowskiej części widma ramanowskiego. Linią demarkacyjną widma ramanowskiego jest linia Rayleigha, rozdziela ona część stokesowską od antystokesowskiej. Linię tę w trakcie pomiaru należy wyciąć odpowiednimi filtrami, gdyż ze względu na swe natężenie zdominowałaby całe widmo. Zarówno część stokesowska i antystokesowska zawierają w sobie strukturę oscylacyjna i rotacyjną. Stosunek natężeń linii stokesowskiej i antysokesowskiej związanych z tym samym oscylacyjnym stanem wzbudzonym jest w przybliżeniu następujące:

Wpływ wybranych czynników na natężenie światła rozproszonego ramanowsko

Przejście do nanowersji spektroskopii ramanowskiej wymaga zastanowienia się jakie czynniki odgrywają istotny wpływ na natężenie światła rozproszonego ramanowsko. W uproszczeniu natężenie światła rejestrowanego wyniesie:

Równanie 1

Zaczniemy od kryterium Abbego. Gdy światło pada na badany obiekt pewna jego część ulega odbiciu, a pewna część przechodzi przez obiekt a bieg promieni ulega ugięciu (oczywiście jeśli obiekt jest wystarczająco przeźroczysty). Standardowo jest tak, że detektor zbierający rozproszone fotony jest umieszczony daleko, stąd też dociera do nas informacja z tzw. dalekiego pola. Jeśli się przyjrzeć powierzchni ciała rozpraszającego, które jest przewodnikiem, to w wyniku oddziaływania ze światłem pojawiają się pewne lokalne zmiany gęstości ładunku, a tym samym generują się lokalne prądy. One to znajdują swoje odzwierciedlenie w postaci fal elektromagnetycznych, które składają się z części ewanescentnej (zanikającej wraz z oddalaniem się od powierzchni, mówimy o fali zanikającej), tzw. bliskiego pola, i części, która propaguje się na duże odległości, tzw. dalekiego pola. Tę ostatnią część rejestrujemy przy użyciu detektorów. Niestety nie zawiera ona szczegółów dotyczących lokalnych własności badanego obiektu, a jedynie informację uśrednioną. Gdy umieści się próbnik/detektor bardzo blisko (w odległości rzędu długości fali) powierzchni można rejestrować ewanescentną część promieniowania. Metodą, która pozwala zbliżyć niewielki detektor tak blisko badanej próbki, jest mikroskopia sondy skanującej. Detektorem może być zarówno ostrze mikroskopu tunelowego, jak i ostrze mikroskopu sił atomowych. Wtedy detektor ma za zadanie rozproszyć światło z fali ewanescentej tak by informacja o badanej próbce została przeniesiona na falę elektromagnetyczną dalekiego pola, której źródłem będzie ostrze. Można również detektor przygotować inaczej. Można przygotować ostrze mikroskopu sił atomowych, tak by na jego końcu znajdowało się wejście do falowodu. Wtedy bezpośrednio rejestrowana jest fala zanikająca. W obu przypadkach problemem pozostaje małe natężenie światła przez wzgląd na znikomą liczbę centrów rozpraszających.

Wzmacnianie sygnału ramanowskiego

Remedium na powyższą trudność są zjawiska wzmacniania sygnału na powierzchni i na ostrzu dzięki wykorzystaniu rezonansu plazmonowego. W czym rzecz. W 1974 r.Fleischmann, Hendra, McQuillan [1] zaobserwowali wzmocnienie sygnału ramanowskiego podczas badania pirydyny naniesionej na chropowate srebrne elektrody. Wysunęli wtedy hipotezę, że wzmocnienie sygnału wynika ze zwiększonej liczby rozpraszających molekuł, co ich zdaniem miało być związane ze zwiększeniem się liczby miejsc adsorpcji ze względu na dużą chropowatość powierzchni. Wkrótce, w 1977r. Jeanmaire i Van Duyne [2] oraz Albrecht i Creighton [3] wykazali, że nie jest to efekt zwiększonej liczby zaadsorbowanych molekuł, wnioskując stąd, że zmianie mogą podlegać natężenie światła padającego oraz przekrój czynny na rozpraszanie (patrz Równanie 1). Następnego roku, King, Van Duyne, Schatz [4], nazywają obserwowany efekt wzmocnionym powierzchniowo rozpraszaniem ramanowskim (ang. Surface Enhanced Raman Scattering, SERS*). Wkrótce zjawisko SERS zaczęto wykorzystywać w spektroskopii ramanowskiej w celu wzmacniania sygnału od małej ilości materiału molekularnego.

Spróbujemy, w możliwie najprostszy sposób, intuicyjnie wytłumaczyć zjawisko SERS. Obserwuje się wzmocnienie rozproszonego promieniowania ramanowskiego na chropowatej powierzchni (patrz 3). Chropowatą powierzchnię można traktować w przybliżeniu jako składającą się z aglomeratów nanocząstek i uprościć zagadnienie do rozważania wzmacniania sygnału ramanowskiego w otoczeniu pojedynczej metalicznej nanocząstki. W metalicznych nanocząstkach można wzbudzić rezonans plazmonowy pod wpływem padającego promieniowania elektromagnetycznego (dla przejrzystości wywodu rozważmy składową elektryczną oscylującego pola, E_in .).

Plazmony są to kolektywne oscylacje elektronów przewodnictwa. W metalu objętościowym mogą zostać wzbudzone zarówno przez elektrony przezeń przechodzące, jak również przez padające światło. Plazmony mogą również zostać wzbudzone przy powierzchni materiału i wtedy noszą nazwę plazmonów powierzchniowych, a ich częstość jest mniejsza niż plazmonów objętościowych,   , gdzie  oznacza częstość plazmonową dla materiału objętościowego, n jest gęstością nośników, – ładunkiem elementarnym, – stała dielektryczna próżni, a – masa elektronu.

Na czym jednak polega mechanizm powstawania plazmonu w nanocząstce? Padająca fala elektromagnetyczna powoduje przemieszczenie elektronów przewodnictwa proporcjonalne do natężenia chwilowego pola elektrycznego (patrz Rysunek 3). To przesuniecie ładunku ujemnego i obecność nieruchomych rdzeni atomowych o ładunku dodatnim powoduje powstanie chwilowego dipola elektrycznego w naszej NM.

Ów dipol wytwarza pole elektryczne, które próbuje przywrócić stan poprzedni, tj. na elektrony zaczyna działać siła Lorentza proporcjonalna (ze znakiem minus) do tegoż pola. W dużym uproszczeniu otrzymujemy sytuację w której powstająca siła jest proporcjonalna (ze znakiem minus) do początkowego przesunięcia elektronów. Czyli mamy do czynienia z oscylatorem harmonicznym. Jeśli teraz jeszcze weźmiemy pod uwagę, że światło jest oscylującym polem elektrycznym, to mamy wymuszony oscylator harmoniczny. Na koniec uwzględniając obecne cały czas rdzenie jonowe, które będą hamowały ruch naszych elektronów, otrzymujemy wymuszony oscylator tłumiony. Oczywistym jest zatem, że dobierając odpowiednio częstość pola wymuszającego ruch elektronów będziemy mieli do czynienia z rezonansem, który w tym przypadku nosi nazwę rezonansu plazmonowego. Zakładając, że NM ma kształt kuli możemy powiedzieć, że częstość rezonansowa wyniesie .

Oscylujące w nanocząstce elektrony można traktować jako oscylujący dipol. Stają się one źródłem promieniowania elekromagnetycznego, :

Równanie 2

Po pierwsze, zauważmy silną zależność natężenia pola od odległości od nanocząstki – efekt bliskiego pola. Po drugie, jeśli tylko znajdziemy materiał dla którego przenikalność elektryczna spełni zależność , to pole oscylującego dipola będzie bardzo silne. Ponieważ pole padające, E_in , oraz pole dipola, E_w, mają tę samą częstość nastąpi wzmocnienie natężenia pola padającego na molekuły, co korzystnie wpływa na rejestrowane promieniowanie rozproszone ramanowsko. Co więcej, świtało rozproszone ramanowsko ma częstość, która niewiele różni się od częstości światła padającego, stąd też wciąż może powodować powstawanie plazmonów w nanocząstce, a tym samym podobny efekt wzmocnienia sygnału już rozproszonego. Ponadto, adsorpcja molekuły na powierzchni metalu może prowadzić do zmiany własności molekuły ze zmianą przekroju czynnego na rozpraszanie ramanowskie włącznie. Opisane pokrótce mechanizmy są uznawane za dwa źródła obserwowanego wzmocnienia i nazywane odpowiednio wzmocnieniem elektromagnetycznym i wzmocnieniem chemicznym (Rysunek 4). Wspólnie oba mechanizmy mogą dać nawet milionkrotne wzmocnienie natężenia światła rozproszonego.

Wzmocnienie elektromagnetyczne jest związane z powstawaniem plazmonów powierzchniowych w nanocząstkach metalicznych. Wracając do chropowatej powierzchni możemy również zauważyć, że dochodzić będzie do koncentracji ładunku na ostrych krawędziach. Eksperymenty z powierzchniami prowadzącymi do efektu SERS pokazują ponadto istnienie tzw. hot spots, miejsc które dają wyjątkowo duże wzmocnienia. Efekt wzmocnienia chemicznego jest związany z chemisorpcją molekuł na powierzchni metalicznej. Istotną rolę w tym procesie odgrywa transfer ładunku między podłożem a molekułą, zatem efekt wzmocnienia chemicznego jest ograniczony jedynie do pierwszej warstwy adsorbatu.

W podsumowaniu należy podkreślić, że SERS jest efektem dotyczącym bliskiego pola i mogą go wykazywać jedynie materiały posiadające swobodne nośniki. Jest liniowym efektem optycznym, tzn. zależy od pierwszej potęgi natężenia światła padającego. Rozmiary struktur rozpraszających mieszczą się w przedziale 10-100nm.

Wzmocnienie ramanowskie na ostrzu sondy

Bardziej istotny dla naszych rozważań jest efekt TERS (ang. Tip Enhanced Raman Scattering**), czyli wzmocnionego na ostrzu rozpraszania ramanowskiego. Zjawisko to można wytłumaczyć obrazowo w następujący sposób. W technice SERS mamy do czynienia z powierzchnią wzmacniającą sygnał ramanowski, na której adsorbujemy molekuły, których widmo chcemy zebrać. Obserwacji dokonujemy przy użyciu tradycyjnej mikroskopii optycznej, bądź bardziej wyszukanej mikroskopii optycznej bliskiego pola. Wyobraźmy sobie teraz, że dysponujemy mapą wzmocnień obserwowanych na naszej powierzchni i jesteśmy w stanie wyselekcjonować wszystkie hot spots. Wybieramy to miejsce, tę nanostrukturę, która daje największe wzmocnienie i umieszczamy ją na ostrzu sondy skanującej mikroskopu AFM bądź STM. Wtedy wzmocnienie sygnału rozproszonego nieelastycznie światła będziemy obserwować jedynie w tych miejscach do których zbliżymy ostrze sondy skanującej.

Propozycja połączenia wysokiej zdolności rozdzielczej techniki STM z efektem SERS padła już w 1985 roku w pracy Wessela [5]. Pierwsze raporty na temat obserwacji efektu TERS pojawiły się jednak dopiero w roku 2000 i dotyczyły mikroskopu AFM [6, 7]. Wyniki udanej realizacji pomysłu Wessela opublikowane zostały w 2002r [8].

Podobnie jak dla efektu SERS, w TERS istotne jest by dopasować się do częstości plazmonowej charakterystycznej dla nanostruktury znajdującej się na końcu skanującej sondy. Dla udanej realizacji konieczne jest przygotowanie specjalnych ostrzy AFM lub STM. Wciąż jest to zagadnienie poddawane intensywnym badaniom. Nieregularne ostrze, może powodować powstawanie wielokrotnych rezonansów. Kolejnym istotnym parametrem jest polaryzacja padającego światła, największe wzmocnienia obserwuje się dla polaryzacji równoległej do osi próbnika. W związku z tym, że TERS jest efektem bliskiego pola, ważna jest odległość próbnik-próbka

Układ pomiarowy do techniki TERS prócz mikroskopu sondy skanującej (AFM lub STM) musi zawierać źródła światła laserowego, spektrometr oraz odpowiedni układ optyczny do prowadzenia wiązki, skupienia jej w miejscu, gdzie znajduje się skanujące ostrze, śledzenia ruchu ostrza oraz zbierania światła rozproszonego. Istnieje wiele możliwych konfiguracji oświetlenia/zbierania światła w mikroskopii opartej na TERS. Można odpowiednio zastosować oświetlenie od spodu w przypadku przeźroczystych próbek, oświetlenie z boku, bądź wykorzystać zwierciadło paraboliczne do oświetlenia z góry [9]. Kluczowe jest odpowiednie wyjustowanie układu, tak by wiązka laserowa była skupiona w miejscu, gdzie ostrze przybliża się do próbki.

Wśród zastosowań techniki TERS warto wymienić możliwość badań własności komórek. Badań, które w odróżnieniu od metod tradycyjnych nie będą wymagały stosowania barwników czy funkcjonalnych nanocząstek dostarczanych do komórki. Skanujące ostrze zapewni wysoką zdolność rozdzielczą, a fakt, że rejestrujemy widma różnych związków zapewni nam selektywność metody. W ten sposób można badać np. rozkład składników lipidowych i białkowych w błonie komórkowej [10].

* Termin SERS może zarówno oznaczać zjawisko jak również metodę badawczą, jeśli w akronimie ostatnią literę S odczytamy jako Spectroscopy (spektroskopia).

** Podobnie jak termin SERS, akronim TERS może zarówno oznaczać zjawisko jak również metodę badawczą, jeśli ostatnią literę S odczytamy jako Spectroscopy (spektroskopia).

[1] Fleischmann, M.; Hendra, P.J.; McQuillan, A.J. Chem. Phys. Lett. 1974, 26, 163-166.

[2] Jeanmaire, D.L.; Van Duyne, R.P. J Electroanal Chem 1977, 84, 1-20.

[3] Albrecht, M.G.; Creighton, J.A. Journal of the American Chemical Society 1977, 99, 5215-5217.

[4] King, F.W.; Van Duyne, R.P.; Schatz, G.C. J. Chem. Phys. 1978, 69, 4472-4481.

[5] Wessel, J. J Opt Soc Am B 1985, 2, 1538-1541.

[6] Stockle, R.M.; Suh, Y.D.; Deckert, V.; Zenobi, R. Chem. Phys. Lett. 2000, 318, 131-136.

[7] Hayazawa, N.; Inouye, Y.; Sekkat, Z.; Kawata, S. Opt Commun 2000, 183, 333-336.

[8] Pettinger, B.; Picardi, G.; Schuster, R.; Ertl, G. Single Mol 2002, 3, 285-294.

[9] Yeo, B.S.; Stadler, J.; Schmid, T.; Zenobi, R.; Zhang, W.H. Chem. Phys. Lett. 2009, 472, 1-13.

[10] Bohme, R.; Cialla, D.; Richter, M.; Rosch, P.; Popp, J.; Deckert, V. J Biophotonics 2010, 3, 455-461.